Az elvált férj be akarja bizonyítani ex-feleségének, hogy képes normális állást találni és példaképül szolgálni jó képességekkel megáldott fiának. Az ultimátum, ahogy az lenni szokott, a következő nap reggele, így Larry Daley (Ben Stiller) kapva kap az alkalmon, hogy a Természettörténeti Múzeumban éjjeliőrt keresnek az addig szolgálatot teljesítő három nagyszájú öregúr helyett, akik már járni is alig tudnak. Ők vezetik be Larryt a tárlatok világába, minden teremhez külön kis kommentárt fűzve, melyeknek értelme csak akkor válik világossá, mikor egyedül marad szolgálati helyén: éjszakára a múzeum életre kel.
Az első, akivel Larry találkozik, nem más, mint egy hatalmas T-Rex-csontváz, aki először nagyon ellenségesen viselkedik, de kiderül, hogy csak az eldobott csontot szeretné visszahozni. Az éjjeliőrnek meggyűlik a baja egy Dexter nevű majommal is, aki nevetségessé teszi őt, és egy oroszlán miatt is bajba keveredik. A múzeum titkába maga Theodor Roosevelt elnök vezeti be a kezdő éjjeliőrt. Kiderül, hogy kb. ötven évvel ezelőtt érkezett a múzeumba Ahkmenrah fáraó szarkofágja és mágikus aranytáblája, és azóta éjszakánként minden kiállítási tárgy életre kel. Fontos azonban, hogy reggelre, mire a nap felkel, mindenki a helyére kerüljön, mert akit elevenségében napfény ér, az hamuvá válik. Találkozhatunk így a filmben majákkal, egy Húsvét-szigeteki szoborral, akinek szenvedélye a rágózás, az amerikai polgárháború arctalan katonáival, rómaiakkal, de még a vadnyugat hőseivel is.
A film konfliktusa a fáraó legendájára épít: a három kirúgott öregember úgy akar bosszút állni, hogy, többek közt, ellopják a fáraó aranytábláját. A múzeumlakók persze összefognak annak érdekében, hogy az aranytábla a helyére kerüljön. Ez közös érdek, hiszen ha nem kaparintják vissza a tablát, soha többet nem válhatnak élőkké.
Az Éjszaka a múzeumban készítői bizonyára arra gondoltak, hogy ezek az életre kelt kiállítási tárgyak remek lehetőséget teremtenek egy film sztorijához, mert majdnem minden korból és földrészről találhatóak itt emberek, állatok és tárgyak. Jó gondolat, ám ez a történelmi kavalkád rengeteg buktatót is magába foglal, többek között azt is, hogy ennyi kultúra megjelenítése a történelmi hűség rovására megy. Ez nem is lenne akkora baj, hiszen akció-vígjátékról van szó, ám néhány dolog nagyon szembetűnő. Az életre kelt történelmi személyek hordoznak magukban valamicskét a saját korukból, de többnyire a mai kor emberére jellemző tulajdonságokkal vannak felruházva. Ez annak érdekében történt így, hogy napjaink poénjai átültethetőek legyenek ebbe a környezetbe is. Mindezek ellenére a már százszor elsütött viccek jól működnek a filmben, egy-két kivételtől eltekintve. Ilyen például Attila, a hun vezér Larry által kezelt lelki betegsége, amit a gyermekkori magány és szeretethiány okozott.
A filmen amúgy látszik, hogy rengeteg pénzt öltek bele: számos trükkel próbálja elkápráztatni a nézőt, a kameramozgások szépen vannak kivitelezve és a kompjúteranimációk is hatásosan elhelyezettek. „Minden jó, ha a vége jó” alapon természetesen a film végére minden megoldódik, apa és fiú kapcsolata rendeződik, és a múzeum lakói is boldogan élnek tovább. Szórakoztató film, többet nem is kell elvárnunk, azonban azt nem hittem volna, hogy a 2006-os év ötödik, anyagilag legsikeresebb amerikai produkciója volt.
